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如何大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞（上）
更新時(shí)間：2021-09-18 瀏覽次數(shù)：3685
近年來(lái)，我國(guó)的生物技術(shù)飛速發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)形成規(guī)模化，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式、細(xì)胞工廠5種技術(shù)形式。
分批式培養(yǎng)是細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早采用的方式，也是其他操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中其體積不變，不添加其他成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物和培養(yǎng)基的操作方式。分批式培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過(guò)程中與外部環(huán)境沒(méi)有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進(jìn)行其他任何控制。因培養(yǎng)期間細(xì)胞生長(zhǎng)代謝是在一個(gè)相對(duì)固定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營(yíng)養(yǎng)成分，直觀反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過(guò)程，是動(dòng)物細(xì)胞工藝基礎(chǔ)條件或小試研究常用的手段。由于培養(yǎng)過(guò)程工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強(qiáng)，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過(guò)程控制，比較其他培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器規(guī)模可達(dá)12000L。細(xì)胞生長(zhǎng)分為五個(gè)階段延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。
分批培養(yǎng)的周期時(shí)間多在3-5d，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（48-72h)細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)周期。
收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。
BioCore QC臺(tái)式細(xì)胞生物反應(yīng)器
流加式培養(yǎng)是在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2-1/3，在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程沒(méi)有流出或回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止，回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。流加培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的流加速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過(guò)程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。培養(yǎng)過(guò)程以低稀釋率流加，細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時(shí)間較長(zhǎng)，總細(xì)胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。流加培養(yǎng)過(guò)程須掌握細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，能量代謝動(dòng)力學(xué)，研究細(xì)胞環(huán)境變化時(shí)的瞬間行為。流加培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個(gè)培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過(guò)程控制，比較其他培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放大。流加培養(yǎng)是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢(shì)的培養(yǎng)工藝，也是近年來(lái)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進(jìn)行流加的時(shí)間多在指數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。可以添加1次，也可添加多次，直至細(xì)胞密度不再提高。? 葡萄糖
葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。
?谷氨酰胺
谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；
大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見(jiàn)的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。
另外，動(dòng)物細(xì)胞在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。
?氨基酸、維生素及其他
主要包括營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸、營(yíng)養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營(yíng)養(yǎng)成分如膽堿、生長(zhǎng)刺激因子。
添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進(jìn)行添加時(shí)，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進(jìn)行脈沖式添加；
其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動(dòng)泵進(jìn)行緩慢連續(xù)流加。
半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。這種類型的操作是將細(xì)胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長(zhǎng)至一定的密度，在細(xì)胞生長(zhǎng)至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1/2-3/4，以維持細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加。或者在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，然后補(bǔ)加細(xì)胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。
剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無(wú)需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過(guò)幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過(guò)程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。半連續(xù)式特點(diǎn)是：培養(yǎng)物的體積逐步增加，可進(jìn)行多次收獲，細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。BioCore QF Pro不銹鋼微生物發(fā)酵系統(tǒng)
